2024 iGEM

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ACNE

KILLER.

XY Yang

22级临床医学五年制杨昕玥

6012022004




XY Yang

22级临床医学五年制杨昕玥

6012022004




Scientist Research

项目介绍

您对痤疮了解多少？

痤疮(acne)是一种基于毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性疾病

多见于青少年时期

80% 的人

曾患有痤疮

15%-20% 的人

患有中度至重度痤疮[1]

80%

15%

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20%

尽管痤疮是一种非致死性并且具有自愈倾向的疾病，但该病病程长，容易遗留影响外貌的凹陷性和增生性瘢痕或色素沉着，严重影响患者的心理健康和生活质量。[2]


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痤疮的影响

痤疮的影响

对患者皮肤造成损害


更严重的是，会增加患者

产生焦虑、抑郁的风险

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我们该如何解决它呢

Acne

项目设计


bacteria
White Speech Bubble

我叫

痤疮丙酸杆菌

Science and Research Element Microbe
Torn Yellow Paper

痤疮丙酸杆菌 (C. acnes)


革兰阳性厌氧菌

痤疮的主要致病菌

主要寄生于人类皮肤和黏膜[3]

  • 目前研究表明，痤疮丙酸杆菌与痤疮关系密切，是引起痤疮炎症反应的必不可少的因素之一。进入青春期后，人体皮脂分泌率增高，为痤疮丙酸杆菌的生长提供了有利条件，使得该细菌大量繁殖、迅速生长。


  • 痤疮丙酸杆菌可定植于皮脂腺，释放多种酶类，并促进白细胞和角质细胞产生促炎因子，从而导致局部炎症和诱导角质形成细胞的增殖。同时，皮肤的炎性环境也为痤疮丙酸杆菌的进一步增殖提供了生长环境。


  • 痤疮丙酸杆菌以皮脂为食，尤其是皮脂腺细胞产生的甘油三酯。侵入皮脂腺的痤疮丙酸杆菌会释放多种生物活性酶，如脂肪酶、蛋白酶和透明质酸酶，这些酶可分解皮脂中的甘油三酯，产生游离脂肪酸和低分子量肽。同时，游离脂肪酸可刺激毛囊壁引起炎症，刺激毛囊皮脂腺导管增生和过度角化，导致皮脂分泌和排泄受阻，从而增加痤疮的发病率。[4]
Thinking Emoji

基于上述内容，我们设想是否可以通过限制脂肪酶分解甘油三酯的能力，实现降低痤疮发病率的目标？

在对单个痤疮丙酸杆菌进行编辑之前，我们考虑到微生物种群的特殊生物现象——群体感应

群体感应(QS)

群体感应是指微生物通过监测种群密度调控群体行为的生物现象。微生物分泌可扩散的信号分子并在环境中累积。当信号分子达到一定的阈值时，信号分子与受体结合，并通过一系列级联反应调节基因表达和生理活性，如生物膜的形成、胞外酶分泌、抗菌物质合成、感受态、毒力因子表达等。[5]

研究表明，痤疮丙酸杆菌中存在自诱导因子-2(AI-2)群体感应系统。信号分子AI-2介导的群体感应不仅可以促进生物膜的形成，还会增加脂肪酶等毒力因子的产生，从而刺激免疫系统并引发痤疮炎症。[6]

#ERROR!

由此，我们希望建立以自诱导因子-2(AI-2)为中心的基因线路系统，通过监测AI-2水平，掌握痤疮丙酸杆菌群体密度以及致炎程度

插画

感知

通过基于 LuxP 的荧光共振能量转移(LuxP-FRET)报告系统检测法测定痤疮丙酸杆菌中的 AI-2 水平

AI-2

LuxP

CFP

YFP

CLPY

overlap

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AI-2 水平

对A1-2的接收蛋白LuxP进行修饰，在LuxP的N端和C端融合CFP蛋白(蓝绿色荧光蛋白)和YFP蛋白(黄色荧光蛋白)，该融合蛋白称为CLPY。当A1-2与之结合，会诱导两个荧光基团之间发生荧光共振能量转移(FRET)，A1-2浓度的增加会导致FRET比值(OD527/OD485)减小。用光度计测量FRET比值，随后A1-2的浓度可以通过FRET比与体外A1-2己知浓度的标准曲线进行计算。样品和CLPY一起孵育，将CLPY蛋白纯化后可以快速有效地检测大量样品。[7]

插画

响应-抑制机制

当检测到较高浓度AI-2，即启动后续的响应-抑制机制

抑制

对象

脂肪酶

一类催化甘油三酯水解为甘油和脂肪酸的酶

甘油三酯脂肪酶(ATGL)是脂肪细胞将甘油三酯(TG)水解为甘油二酯(DG)的限速酶[9]。

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设想

我们设想有机制可抑制 ATGL 的功能，从而限制甘油三酯水解为甘油二酯并产生游离脂肪酸

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通过查阅大量文献，一种特殊的蛋白质引起了我们的注意

G0S2

G0S2

  • 由G0/G1开关基因(G0S2)编码的蛋白质，它是ATGL的选择性调节因子。G0S2通过其疏水结构域和ATGL的patatin样结构域结合，实现与ATGL的特异性相互作用。


  • 更重要的是，可以通过G0S2与ATGL的相互作用抑制ATGL的TAG水解酶活性，并且过量表达G0S2会降低脂肪细胞和脂肪组织外泌体的脂肪分解率。[8]
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Gene Editing Icon

设想

改造基因线路的痤疮丙酸杆菌可以实现这一目的

宠物扁平派对插画-路障

然而，在痤疮丙酸杆菌菌株KPA171202中发现限制性修饰系统(Restriction and Modification Systems, R-M systems)，该系统包含ⅢB甲基化酶，会阻碍DNA的传递。[10]

Line Detail Flowers

为了克服原核生物的R-M系统，目前已有学者创建了一种携带痤疮丙酸杆菌ⅢB甲基化酶的ΔdamΔdcmΔhsdMS大肠杆菌菌株，并将其命名为EC-24，该菌株产生的DNA不具有大肠杆菌特异性甲基化，而是模仿痤疮丙酸杆菌KPA171202的甲基化模式。[11]


由此，出于实验操作的便利性、遗传工程的可控性以及技术成熟度，我们选择在改良后的大肠杆菌中进行基因编辑和表达，再将其转移到痤疮丙酸杆菌底盘，以实现特定基因的表达和调控。

粗线可变色通用流行插画-有灵感
Woman Looking at the Mirror
插画

反馈

在整个治疗过程中，定期监测皮脂腺中游离脂肪酸、AI-2、G0S2和其他炎症细胞因子(如 IL-1β、IL-6 和 TNFα)的水平以及相应的痤疮改善情况

通过不断反馈、反思和改进，确保各步骤的安全性和有效性

线路与元件

痤疮丙酸杆菌的基因敲除 KO 和基因敲入 KI
Number 1 Icon

胸苷激酶基因(tdk)的基因敲除

缺乏胸苷激酶基因(tdk)的菌株无法将5′-氟-2′-脱氧尿苷(FUDR)代谢为有毒化合物，因此FUDR存在的情况下不会抑制RNA和DNA的合成，从而菌株可以正常生长[12]。

在FUDR存在的条件下，胸苷激酶基因tdk敲除菌株的阴性选择生长[11]

Number 2 Icon

G0S2基因和红霉素抗性基因的基因敲入

G0S2基因经转录和翻译产生G0S2蛋白，随后通过与ATGL相互作用，调节其催化甘油三酯分解的功能

在红霉素存在的条件下，红霉素抗性基因ermE敲入菌株的阳性选择生长[11]

Number 3 Icon

双重选择机制建立

  • 我们将靶向胸苷激酶基因tdk，并将其取代为G0S2基因和红霉素抗性基因，从而建立双重选择机制，提高转化和筛选效率。


  • 我们将使用含有抑制剂FUDR以及红霉素的平板：野生型(WT)痤疮丙酸杆菌在某些浓度的抑制剂作用下无法生长，而成功转化的菌株在所有浓度下均能生长。[11]

预期筛选结果

Culture Dish
Bacteria
Grunge X Mark
Culture Dish
Bacteria

野生型痤疮丙酸杆菌

成功转化的痤疮丙酸杆菌

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Bacteria
Grunge X Mark
Culture Dish
Bacteria

野生型痤疮丙酸杆菌

成功转化的痤疮丙酸杆菌

含有抑制剂FUDR的平板

含有红霉素的平板

Pink Bacteria Illustration

基因线路

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  • 我们以改良后的大肠杆菌为载体，以痤疮丙酸杆菌为底盘进行基因线路设计。


  • 当接收蛋白LuxP感知到痤疮丙酸杆菌中AI-2浓度达到一定阈值时，AI-2相应的强组成型启动子promoter将被激活，并表达后续基因。


  • 我们将把G0S2基因与来自痤疮丙酸杆菌的分泌信号融合，并加入红霉素抗性基因以实现转化子的阳性选择。最后，通过靶向胸苷激酶基因，以同源重组形式将新构建基因组稳定地插入原基因组。


  • 由此，在转化成功的痤疮丙酸杆菌中，G0S2可实现ATGL的选择性调节，当皮脂腺内ATGL增加时，G0S2可通过与ATGL结合，降低脂肪分解率。随着甘油三酯分解过程受抑制，其分解产物游离脂肪酸也随之减少，从而实现降低痤疮的发生率。

实验内容

Science Element Microscope

实验设计

1.细菌菌株培养

  • 在37℃厌氧条件下培养痤疮丙酸杆菌；


2.AI-2的生物学测定

  • 基于LuxP的荧光共振能量转移(LuxP-FRET)报告系统检测法；


3.转化效率测定

  • 用荧光标记的寡核苷酸测定痤疮丙酸杆菌中DNA的转化率和稳定性；
  • 使用含有抑制剂FUDR或红霉素的平板，筛选成功进行基因敲除和敲入的痤疮丙酸杆菌并评估其效率；


4.G0S2可行性测定

  • 通过qPCR分析，检测G0S2在转化成功的痤疮丙酸杆菌中的表达情况；


5.G0S2效率测定

  • 通过建立由花生四烯酸刺激的炎症模型，测定G0S2蛋白在降低游离脂肪酸水平方面的有效性；


6.安全测试

  • 测试痤疮丙酸杆菌工程菌株能否接种皮肤；
  • 测试G0S2蛋白的潜在细胞毒性；
  • 测试炎症细胞因子如白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达水平


Scientist Doing Experiment in the Laboratory

后续，我们将在大鼠和猪等动物皮肤上进行实验，

进一步验证治疗效果，以获得更有说服力的体内实验数据

人类实践

3D Floating Element Folder
矢量对话框

"Human Practices is the study of how your work affects the world, and how the world affects your work."

——Peter Carr, Director of Judging

渐变圆角矩形

我们应在iGEM周期的每个阶段都纳入 "人类实践"

Make introductions turquoise concept icon
渐变圆角矩形

学校、医院和研究机构三位一体，相互促进

Scientist Research
双头箭 double ended arrow
双头箭 double ended arrow
communication
双头箭 double ended arrow
Building School Classroom
hospital
医师健康讲堂组合插画-医师
校园人物扁平插画
  • 利用我校现有的丰富医疗资源，我们计划走进各大中小学，开展针对各年龄段学生的科普活动，专门宣传有关痤疮病因和治疗方法的科学知识，希望让青少年认识到，痤疮是青春期的一种常见病症，不必过分担心甚至因此感到自卑。我们还计划组织专题讨论和互动环节，与青少年深入交流，希望能够通过交流，更全面地了解他们目前对于痤疮的焦虑问题、治疗过程中的困难和挑战，以及他们对这一新兴疗法的接受程度。


  • 此外，我们还将安排访问医院皮肤科等诊室，与患者和医疗工作者这两个关键利益相关群体面对面交流，希望深入了解专业人士和潜在受益者对痤疮现状和现存问题的看法，以及他们对这一新疗法的态度、意见和建议。同时希望通过与医疗工作者的交流，获取更多痤疮治疗相关的最新进展和临床实践经验。


  • 我们期望从交互中收集宝贵的反馈意见和数据，以进一步完善实验方法并提高产品的安全性、可靠性。我们将积极采纳各方建议，通过宣传和推广，提高大众对新疗法的认知度和接受度，最大程度地减少大众的顾虑，并最终取得预期的研究成果。
Safety Glove Icon

实验室内外安全保障

在我们的整个实验设计中，安全均是首要考虑因素

为确保实验室内外的安全，我们将：

  1. 利用数学模型来预测、评估各步骤的可行性及有效性
  2. 定期咨询专业人士，汲取意见建议，优化项目
  3. 严格遵守实验室安全规章制度，并定期开展安全培训
  4. 通过动物（如大鼠和猪等）皮肤进行体内实验，以评估疗法安全性和有效性
  • 成功的研究应以人为本，紧密围绕社会需求，并最终为社会带来实质性的有利反馈。在我们的iGEM项目中，我们坚持将人文关怀融入科学研究，确保我们的工作既具科学前瞻性，又兼具社会责任感。我们深刻认识到，痤疮问题不仅涉及皮肤健康，更对青少年的心理健康和社交生活产生重大影响。因此，我们的研究不仅关注痤疮的治疗，更关注其对青少年个体的全方位影响。


责任性

  • 我们对痤疮治疗相关的法规和行为准则进行全面研究，确保项目在法律和伦理框架内进行。且将与皮肤科专家、法律顾问及患者代表等进行深入讨论，以评估我们治疗方法的潜在风险，并制定相应的预防及应对措施，最大程度地减少公众对这些问题的担忧。同时，我们会考虑该治疗方法被滥用的情况，并分析基因编辑菌株在野生环境中的可能影响，将设计策略来降低相关风险。


影响力

  • 我们了解到目前市场上许多药物及治疗手段并未达到预期效果。局部或全身抗生素是目前痤疮治疗的主要手段，但长期使用可能导致痤疮丙酸杆菌耐药性的增强。[13]此外，使用异维甲酸和过氧化苯甲酰等替代药物，可能导致如恶心、皮肤脱落以及皮肤刺痛和灼热感等一系列不良反应。[14,15]因此，我们的项目旨在提供一种新的治疗方法，希望实现有效治疗痤疮，同时避免现有治疗方法副作用的效果。我们坚信，这将有助于促进青少年生理和心理健康。


合作性

  • 我们希望通过跨领域合作，与其他iGEM团队、非营利组织和教育机构，涵盖生物工程、医学、社会学等多个学科背景的伙伴合作，不仅改善痤疮患者的生活水平，更促进合成生物学在社会中的认知和接受度。在合作过程中，致力于吸纳意见建议，进行批判性思考，对项目进行不断调整、改进和完善，实现互利共赢。


  • 我们的项目不只是科学研究，更是以合成生物学为工具与媒介，通过具备责任性、影响力和合作性的人类实践，实现社会各界的交流互助，通过正反馈的正循环，为社会带来积极变革。

参考文献

  1. Burton JL, Cunliffe WJ, Stafford I, Shuster S. The prevalence of acne vulgaris in adolescence. Br J Dermatol. 1971 Aug;85(2):119-26. doi: 10.1111/j.1365-2133.1971.tb07195.x. PMID: 4255129.
  2. 李晓娟,林新瑜.痤疮丙酸杆菌与痤疮炎性反应关系的研究进展[J].临床皮肤科杂志,2017,46(2):142-145
  3. Grice EA, Kong HH, Conlan S, Deming CB, Davis J, Young AC; NISC Comparative Sequencing Program; Bouffard GG, Blakesley RW, Murray PR, Green ED, Turner ML, Segre JA. Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome. Science. 2009 May 29;324(5931):1190-2. doi: 10.1126/science.1171700. PMID: 19478181; PMCID: PMC2805064.
  4. Contassot E, French LE. New insights into acne pathogenesis: propionibacterium acnes activates the inflammasome. J Invest Dermatol. 2014 Feb;134(2):310-313. doi: 10.1038/jid.2013.505. PMID: 24424454.
  5. Zeng X, Zou Y, Zheng J, Qiu S, Liu L, Wei C. Quorum sensing-mediated microbial interactions: Mechanisms, applications, challenges and perspectives. Microbiol Res. 2023 Aug;273:127414. doi: 10.1016/j.micres.2023.127414. Epub 2023 May 20. PMID: 37236065.
  6. Hamada S, Minami S, Gomi M. Heparinoid enhances the efficacy of a bactericidal agent by preventing Cutibacterium acnes biofilm formation via quorum sensing inhibition. J Microorg Control. 2024;29(1):27-31. doi: 10.4265/jmc.29.1_27. PMID: 38508759.
  7. Taga, M. E., & Xavier, K. B. (2011, November). Methods for Analysis of Bacterial Autoinducer‐2 Production. Current Protocols in Microbiology, 23(1). https://doi.org/10.1002/9780471729259.mc01c01s23
  8. Yang, X., Lu, X., Lombès, M., Rha, G. B., Chi, Y. I., Guerin, T. M., Smart, E. J., & Liu, J. (2010, March). The G0/G1 Switch Gene 2 Regulates Adipose Lipolysis through Association with Adipose Triglyceride Lipase. Cell Metabolism, 11(3), 194–205. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2010.02.003
  9. Jaeger KE, Reetz MT. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends Biotechnol. 1998 Sep;16(9):396-403. doi: 10.1016/s0167-7799(98)01195-0. PMID: 9744114.
  10. Knödlseder N, Nevot G, Fábrega MJ, Mir-Pedrol J, Sanvicente-García M, Campamà-Sanz N, Paetzold B, Lood R, Güell M. Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting. PLoS Pathog. 2022 Mar 28;18(3):e1010420. doi: 10.1371/journal.ppat.1010420. PMID: 35344565; PMCID: PMC8989293.
  11. Knödlseder N, Fábrega MJ, Santos-Moreno J, Manils J, Toloza L, Marín Vilar M, Fernández C, Broadbent K, Maruotti J, Lemenager H, Carolis C, Zouboulis CC, Soler C, Lood R, Brüggemann H, Güell M. Delivery of a sebum modulator by an engineered skin microbe in mice. Nat Biotechnol. 2024 Jan 9. doi: 10.1038/s41587-023-02072-4. Epub ahead of print. PMID: 38195987.
  12. Norville, J. E., Gardner, C. L., Aponte, E., Camplisson, C. K., Gonzales, A. S., Dk, B., Ka, T., L., Mincheva, M., Teramoto, J., Tominaga, K., Sugimoto, R., Je, D., Güell, M., Hysolli, E., Aach, J., Cj, G., Bl, W., & Church, G. M. (2016, August 19). Assembly of Radically Recoded E. coli Genome Segments. bioRxiv (Cold Spring Harbor Laboratory). https://doi.org/10.1101/070417
  13. Al-Momani H, Massadeh MI, Almasri M, Al Balawi D, Aolymat I, Hamed S, Albiss BA, Ibrahim L, Balawi HA, Al Haj Mahmoud S. Anti-Bacterial Activity of Green Synthesised Silver and Zinc Oxide Nanoparticles against Propionibacterium acnes. Pharmaceuticals (Basel). 2024 Feb 16;17(2):255. doi: 10.3390/ph17020255. PMID: 38399471; PMCID: PMC10891609.
  14. Gollnick HP. From new findings in acne pathogenesis to new approaches in treatment. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2015 Jun;29 Suppl 5:1-7. doi: 10.1111/jdv.13186. PMID: 26059819.
  15. Vallerand IA, Lewinson RT, Farris MS, Sibley CD, Ramien ML, Bulloch AGM, Patten SB. Efficacy and adverse events of oral isotretinoin for acne: a systematic review. Br J Dermatol. 2018 Jan;178(1):76-85. doi: 10.1111/bjd.15668. Epub 2017 Dec 8. PMID: 28542914.